Permintaan terhadap produk obat berupa protein terapeutik berbasis bioteknologi semakin banyak seiring dengan peningkatan kemampuan teknologi mutakhir dan ilmu pengetahuan dalam bidang biologi molekuler, khususnya rekayasa teknologi. Human Granulocyte-colony stimulating factor (hG-CSF atau G-CSF) adalah suatu glikoprotein hormon manusia yang tergolong sebagai cytokine, memiliki aktivitas biologis dan aplikasi terapeutik. Granulocytes, khususnya neutrofil, adalah komponen penting dalam sistem pertahanan tubuh terhadap infeksi. Ia adalah bagian dari sel darah putih (leukosit), mengandung beberapa protein, seperti neutrofil, basofil, dan eosinofil. Produksi neutrofil dalam tubuh berkurang akibat, antara lain kemoterapi kanker, infeksi virus, dan infeksi bakteria. Tujuan umum penelitian adalah membuat dan memproduksi senyawa biosimilar protein terapeutik rekombinan hG-CSF (rhG-CSF) pada sistem ekspresi eukaryot, khususnya ragi melalui pendekatan biologi sintetik. Sasaran umum penelitian ini adalah memperoleh cara dan sumber alternatif yang memiliki potensi tinggi untuk produksi senyawa biosimilar protein terapeutik rhG-CSF yang potensial untuk aplikasi pada industri farmasi dan menunjang program kesehatan, khususnya pengobatan kanker. Prosedur penelitian meliputi konstruksi gen sintetik CSF3syn, kloning gen sintetik CSF3syn dan analisis plasmid rekombinan, analisis sekuen DNA gen sintetik dalam plasmid kloning, kloning gen sintetik CSF3syn ke dalam plasmid pPICZa, kloning gen sintetik CSF3syn ke dalam plasmid pET21, transformasi plasmid rekombinan pPICZdelta-CSF3syn pada Pichia pastoris dan seleksi transforman, transformasi plasmid rekombinan pET21-CSF3syn pada Escherichia coli dan seleksi transforman, dan analisis ekspresi protein rekombinan pada P. pastoris dan E. coli transforman. Pada tahun pertama (2008) dan kedua (2009) telah berhasil dilakukan konstruksi gen sintetik, kloning gen sintetik dalam plasmid ekspresi, dan analisis urutan DNA gen sintetik. Gen CSF3syn telah berhasil dikonstruksi dengan dua metode berbeda, yaitu metode TBIO dan TBC (metode DA dan OE-PCR). Sekuen gen CSF3syn yang didesain menggunakan program DNA Works 3.1 telah berhasil dikonstruksi dan klon dengan sekuen yang diharapkan telah diperoleh. Gen CSF3syn yang dikonstruksi dengan metode TBIO didesain mengandung kodon yang dioptimasi untuk ekspresi pada ragi P. pastoris. Gen CSF3syn ini (disebut CSF3syn-Je) mengandung 43,67 persen GC, mirip dengan kandungan GC pada P. pastoris (-45 persen). Sementara itu, gen human-GSF3 memiliki kandungan GC jauh lebih tinggi (65,71 persen). Gen dengan panjang sekitar 558 pb tersebut dikonstruksi dari 14 oligonukleotida berukuran panjang rata-rata 60 nt. Pada gen tersebut ditambah sekuen proteolitik KREAEA dan situs restriksi XhoI dan SalI. Gen telah berhasil dikonstruksi, diklon dalam plasmid kloning dan dianalisis urutan DNA. Tingkat kesalahan konstruksi gen tersebut adalah 0,72 persen. Sekuen gen yang tepat telah berhasil diperoleh setelah melakukan perbaikan sekuen terhadap salah satu klon CSF3syn. Satu versi lain CSF3syn yang dikonstruksi dengan metode TBC didesain mengandung kodon yang dioptimasi untuk ekspresi pada E. coli. Gen CSF3syn ini (disebut CSF3syn-ec) mengandung 61,33 persen GC, mirip dengan kandungan GC pada human-GSF3 (65,71 persen). Gen dikonstruksi dari 12 oligonukleotida berukuran panjang rata-rata 60 nt. Gen telah berhasil dikonstruksi dan tiga dari enam klon yang dianalisis menunjukkan urutan DNA yang 100 persen sesuai dengan sekuen yang didesain. Tingkat kesalahan konstruksi gen dengan metode TBC adalah 0,13 persen. Hal ini menunjukkan bahwa metode TBC terlihat jauh lebih efektif dan lebih akurat dibandingkan metode TBIO dalam konstruksi gen sintetik CSF3syn. Sementara itu, sebagian besar target penelitian pada tahun ketiga (2010), kecuali uji bioaktivitas, telah berhasil dicapai, yaitu konstruksi vektor rekombinan pPICZdelta-CSF3syn dan pERR-CSFsyn; transformasi vektor rekombinan pada P. pastoris dan E. coli; skrining dan seleksi transforman yang stabil, ekspresi protein hG-CSF rekombinan dari sel transforman; produksi dan purifikasi protein rekombinan. Analisis molekuler sel transforman dan fenotipe Mut pada P. pastoris transforman masih berlangsung. Hasil sementara menunjukkan bahwa dari tujuh klon independen P. pastoris GS 115/CSF3syn transforman yang diuji, dua klon di antaranya menunjukkan perubahan fenotipe dari Mut (+) menjadi Mut (-). Hal ini mengindikasikan bahwa rekombinasi homologus berlangsung, baik dengan cara insersi maupun substitusi pada DNA genomik ragi. Adapun uji bioaktivitas masih berlangsung karena purifikasi protein rekombinan masih belum optimal dan proses purifikasi lanjut masih berlangsung. Disimpulkan bahwa tahap pertama sasaran utama penelitian yang berlangsung selama tiga tahun telah tercapai. Tahap kedua penelitian ini, yang diproyeksikan selama tiga tahun ke depan, adalah validasi protein hG-CSF rekombinan dan uji praklinis (pada hewan) yang selanjutnya siap digunakan untuk uji klinis. Oleh karena itu, sangat diharapkan bahwa penelitian ini dapat berlangsung ke tahapan selanjutnya agar dapat merealisasikan suatu produk yang bermanfaat. (KT) (2010)